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Optics11公司PIUMA奈米壓痕在水凝膠中的應用

 釋出時間│▩✘:2022-11-28 點選量│▩✘:239

題目│▩✘:人心房成纖維細胞對基質剛度異質性的適應

(如果需要完整文獻請與我們工作人員聯絡▩•◕·▩,可試樣)

摘要│▩✘:纖維化與衰老和許多心臟病有關·╃。其特徵在於肌成纖維細胞分化和細胞外基質蛋白的過度積累·╃。纖維化相關的組織重塑導致組織結構和功能的顯著變化▩•◕·▩,包括被動機械效能·╃。隨著最近開發的新工具和方法▩•◕·▩,該研究領域獲得了顯著的發展▩•◕·▩,以更好地表徵和理解細胞感知和響應其生物物理環境的能力·╃。我們使用一種稱為CyPhyGel的新型水凝膠來提供與重塑相關的組織硬度變化的先進體外模型·╃。基於藍藻光敏色素的光控二聚化▩•◕·▩,它能夠以高空間和時間解析度對水凝膠機械效能進行非接觸式和可逆調諧·╃。在CyPhyGels上培養人原代心房成纖維細胞·╃。在硬質(~4.6 kPa)或軟質(~2.7 kPa)CyPhyGels上培養4天后▩•◕·▩,我們分析了成纖維細胞面積和硬度·╃。與在較硬的基質上生長的細胞相比▩•◕·▩,在較軟的基質上生長的細胞更小更軟·╃。當軟質和硬質生長底物組合在單個CyPhyGel中時▩•◕·▩,不存在這種差異▩•◕·▩,產生的細胞面積與均質剛性凝膠上的細胞面積相似▩•◕·▩,細胞剛度與均質軟基質上的細胞剛度相似·╃。使用CyPhyGels在體外模擬組織硬度異質性▩•◕·▩,我們的結果證實了心臟成纖維細胞適應其機械環境的能力▩•◕·▩,並表明存在一種旁分泌機制▩•◕·▩,該機制可以調整與機械誘導的表型向肌成纖維細胞轉化相關的成纖維細胞結構和功能特性·╃。在區域性組織硬度增加的情況下▩•◕·▩,例如在瘢痕形成或瀰漫性纖維化時▩•◕·▩,這種機制可以幫助防止正常組織和患病組織之間邊界區域的細胞特性突然變化·╃。CyPhyGeles的光可調機械效能及其對研究人類原代心臟細胞的適用性使其成為心臟力學生物學研究的有吸引力的模型系統·╃。進一步的研究將探索生物物理和可溶性因素在心臟成纖維細胞對空間和時間異質機械線索的反應中的相互作用·╃。

一◕↟•、介紹

由於衰老◕↟•、機械超負荷或損傷等原因引起的心臟組織損傷與纖維化的發展有關·╃。纖維化的特徵在於肌成纖維細胞分化和細胞外基質(ECM)蛋白的過度積累(Herum等人▩•◕·▩,2017)·╃。這種重塑主要是由成纖維細胞驅動的(Manabe等人▩•◕·▩,2002;Travers等人▩•◕·▩,2016)▩•◕·▩,組織結構和力學的變化▩•◕·▩,其後果從心輸出量受損到心律失常脆弱性增加(Nguyen和Qu▩•◕·▩,2014)·╃。最終▩•◕·▩,纖維化的存在和程度是心臟性猝死的主要危險因素(Disertori等人▩•◕·▩,2016)·╃。到目前為止▩•◕·▩,還沒有有效的治療方法來逆轉心臟纖維化▩•◕·▩,主要是由於對潛在的基本機制瞭解不足·╃。

可能的治療方法必須考慮組織力學的變化▩•◕·▩,這既是重塑的原因▩•◕·▩,也是重塑的結果·╃。成纖維細胞對其機械環境的感知已被證明在纖維化重塑中發揮作用(Hinz▩•◕·▩,2013;範普滕等人▩•◕·▩,2016 年)·╃。近年來▩•◕·▩,已經開發了幾種體外模型來研究成纖維細胞機械感測·╃。這些模型中的主要一類使用合成基材▩•◕·▩,包括水凝膠和有機矽·╃。這些允許研究人員規定培養細胞的機械環境(Rosales和Kristi▩•◕·▩,2016;李等人▩•◕·▩,2018)·╃。或者▩•◕·▩,天然存在的底物▩•◕·▩,如脫細胞組織(Ott等人▩•◕·▩,2008)或活的心臟組織切片(Perbellini等人▩•◕·▩,2018)已被用於為細胞提供近生理生長底物▩•◕·▩,但這些是更復雜且可重複性較差的模型·╃。更接近地模擬體內條件的底物是的▩•◕·▩,因為當ECM生產克服退化時▩•◕·▩,纖維化組織的整體剛度提高(Levental等人▩•◕·▩,2010)▩•◕·▩,剛度分佈是高度異質的·╃。具有或多或少ECM的區域構成了不同的機械微域·╃。在瀰漫性纖維化中▩•◕·▩,例如在心房顫動中▩•◕·▩,僵硬的ECM島分佈在較軟的組織中(Tanaka等人▩•◕·▩,2007)·╃。鑑於對單細胞的機械效應主要由其微環境主導▩•◕·▩,體外模型應複製這些剛度異質性▩•◕·▩,理想情況下以可控的方式·╃。

允許在機械效能中引入空間梯度的模型已被用於證明成纖維細胞的剛度引導遷移▩•◕·▩,這一過程稱為durotaxis▩•◕·▩,取決於基質蛋白的型別(Hartman等人▩•◕·▩,2017)·╃。此外▩•◕·▩,具有微圖案剛性和軟區域的水凝膠用於顯示細胞在各種剛度上的適應性(Sunyer等人▩•◕·▩,2012)▩•◕·▩,並研究基質組織對間充質幹細胞分化的作用(Yang等人▩•◕·▩,2016)·╃。然而▩•◕·▩,這些模型不允許人們在時間或空間上動態和可逆地改變生長基質的被動機械效能·╃。基於藍藻光敏色素Cph1的新型水凝膠系統(我們在這裡稱為CyPhyGel)可以透過允許水凝膠硬度的光控▩•◕·▩,可逆變化來解決這一限制(Hörner等人▩•◕·▩,2019b)·╃。為此▩•◕·▩,使用細胞相容的紅光在其單體(740nm)或二聚體(660nm)形式之間切換Cph1▩•◕·▩,從而分別以非接觸方式減少或增加生長基質中的交聯數量·╃。CyPhyGels的剛度可以在1.5和5.5 kPa(有效楊氏模量)之間變化·╃。剛度的變化發生在照明的幾秒鐘內▩•◕·▩,是可分級的▩•◕·▩,在沒有光線的情況下是穩定的▩•◕·▩,並且是可逆的(Hörner等人▩•◕·▩,2019b)·╃。在這項研究中▩•◕·▩,我們使用CyPhyGels來研究人類心臟成纖維細胞對杜羅抗性以外機械環境剛度異質性的適應·╃。

二◕↟•、材料和方法

CyPhyGels和成纖維細胞的奈米壓痕

有效楊氏模量▩•◕·▩,E伊芙▩•◕·▩,使用Chiaro奈米壓痕系統(Optics11▩•◕·▩,荷蘭阿姆斯特丹)進行評估·╃。連線到校準懸臂上的球形用於壓痕樣品▩•◕·▩,同時將鐳射束照射到反射懸臂表面上·╃。對反射的鐳射進行干涉分析▩•◕·▩,以測量與懸臂彎曲相關的相移·╃。由此計算出樣品壓痕所需的力·╃。E伊芙使用接觸力學的赫茲模型推導(赫茲▩•◕·▩,1881;陳▩•◕·▩,2014)假設不可壓縮材料的泊松比為0.5▩•◕·▩,通常用於細胞和組織的機械測試(圖1B;Guz 等人▩•◕·▩,2014 年)·╃。在整份手稿中▩•◕·▩,E伊芙稱為剛度·╃。以5 μm/s的置換速度進行2–4 μm的樣品壓痕·╃。資料分析使用 Optics11 DataViewer (V2.0.27)·╃。

Chiaro人體組織和軟材料的機械效能-杭州軒轅科技有限公司

對於CyPhyGel表徵▩•◕·▩,使用了彈簧常數為0.45–0.5 N/m且半徑為20–23 μm的懸臂·╃。對於細胞評估▩•◕·▩,使用彈簧常數為0.01-0.02 N/m的懸臂和半徑為3-3.5μm的·╃。透過在兩到三個與細胞核不重疊的不同位置進行表面法向壓痕來確定單個細胞的剛度·╃。對於每個壓痕▩•◕·▩,使用赫茲模型來擬合從初始細胞表面接觸到1μm壓痕的力 - 位移曲線▩•◕·▩,以避免來自底層生長基質的機械干擾·╃。在接種CyPhyGels後4天評估細胞硬度·╃。

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結果

透過光調節CyPhyGels的機械效能

均勻暴露在660 nm照明下的CyPhyGels具有E伊芙4.59 ± 0.11 kPa▩•◕·▩,而用 740 nm 照明後▩•◕·▩,E伊芙分別為 2.72 ± 0.06 kPa(圖 2A▩•◕·▩,)·╃。相似的最大值和最小值 E伊芙發現了異質CyPhyGels的兩個差異調諧的一半·╃。為了對剛度梯度進行空間表徵▩•◕·▩,以50μm的步長繪製了異質CyPhyGels▩•◕·▩,沿著垂直於其剛性和軟性兩半之間邊界的線繪製·╃。E伊芙從 4.48 ± 0.58 變為 2.12 ± 0.30 kPa(圖 2C)·╃。在邊界附近使用更高解析度的步長(5μm)▩•◕·▩,我們發現剛性和軟區域之間的過渡發生在100-150μm的寬頻內(圖2D)·╃。邊界區域的寬度至少在1毫米以上是恆定的(補充圖S3)·╃。

圖2




圖2.CyPhyGels的機械效能·╃。(A)本實驗中使用的CyPhyGel配置的示意圖·╃。(二)E伊芙的CyPhyGels▩•◕·▩,暴露於660或740nm(n = 24)的均勻照明或順序照明▩•◕·▩,因此機械異質(n = 4)▩•◕·▩,透過奈米壓痕測定·╃。(三) E伊芙沿著垂直於三個代表性異質CyPhyGels的剛性和軟性兩半之間邊界的軸▩•◕·▩,說明了凝膠剛度的階躍變化(連續測量點之間的距離為50μm▩•◕·▩,n = 3)·╃。(D)從圖C對凝膠3中的過渡區域進行更高解析度的評估(測量點之間的距離為5μm)·╃。(E) E伊芙在照明後(第0天)和6天后立即從圖C獲得凝膠3▩•◕·▩,對應於實驗的持續時間·╃。


為了評估CyPhyGel剛度的異質性是否隨時間推移而持續▩•◕·▩,在順序照明後6天測量了剛度▩•◕·▩,這對應於實驗的持續時間·╃。具有不同剛度的兩個區域仍然清晰可辨(圖2E)·╃。6天內柔軟區域的硬度略有增加是由於在CyPhyGel處理和細胞培養過程中暴露於外部光線(補充圖S2)·╃。

結論

我們提出了一種新的體外模型▩•◕·▩,適用於研究對基質剛度區域性和時間變化的動態生物學反應·╃。該模型將用於闡明不同機械微環境中細胞之間的通訊機制▩•◕·▩,例如模擬纖維化或瘢痕性心肌·╃。我們的結果表明▩•◕·▩,心臟成纖維細胞對生長基質機械特性的適應可以透過旁分泌因子以及直接的細胞 - 細胞接觸調節·╃。

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生物組織奈米壓痕儀介紹
Piuma奈米壓痕儀的核心部件是其安裝在壓痕移動平臺上極其敏銳的壓痕探頭
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3.進行楊氏模量的測試或者進行多點陣測試·╃。一個內建式的顯微鏡
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產品構件詳細介紹│▩✘:
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在X-Y(12x12mm)範圍內測試樣品
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奈米以及微米級別的生物機械效能

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